Práctica 23.Heces

Heces                                                                                                          19-2-2020

Objetivo 
En esta práctica vamos a aprender a realizar la observación macroscopica y microscópica de heces
Fundamento
En las heces podemos observar con facilidad el grado de digestión de los distintos principios inmediatos, de modo que este examen microscópico es de gran ayuda en el diagnostico de los distintos tipos de patologías relacionadas con el proceso de la digestión
Material
--> Vaso de plastico esteril
--> Espatula
--> Microscopio
--> Portas
--> Mechero
--> Cubre

Reactivos
--> Lugol
--> Sudan III
--> Agua destilada
Procedimiento
1.Preparamos el lugol con una dilucion del 1/3 con 5 ml de lugol y 10 ml de agua destilada
2.Lo mezclamos en un matraz erlemenyer
3.Preparamos el Sudan III, mezclando 0,5 g de Sudan III con 45 ml de etanol 96º, luego lo calentamos en el microondas, los dejamos enfriar y lo filtramos
4.En un tubo de centrifuga depositamos 10 ml de agua destilada y una pequeña cantidad de heces y mezclamos
5.Repartimos la mezcla en dos tubos, uno con almidon y otro con aceite
6.Depositamos una gota de cada tubo en portas diferentes
7. En el porta con la muestra de heces y almidon depositamos 2 gotas de lugol
8.En el porta con la muestra de heces y aceite echamos dos gotas de Sudan III y calentamos el porta con el mechero
9.Observamos al microscopio

Práctica 24. Sangre en heces

Sangre en heces                                                                                              20-2-2020

Objetivo
En esta práctica vamos a aprender a realizar la determinación de sangre oculta en heces por inmunocromatografia
Fundamento 
Por medio de inmunocromatografia vamos a utilizar una muestra de heces y por medio de un Ac anti Hb incluido en la placa podremos saber si existe sangre oculta en heces para un correcto diagnostico
Material
--> Tubo colector con 2ml de 0,1 M de PBS
--> Test Nadal
--> Pipetas pasteur
--> Cronometro
--> Placas de petri


Procedimiento 
1.Adulteramos la muestra de heces con sangre, depositando unas gotas de sangre capilar e un placa de petri y depositando heces
2.Cogimos el tubo colector horizontalmente y abrimos el tapón azul, luego extrajimos el aplicador de muestra de color azul
3.Lo introdujimos en tres puntos distintos de las heces y lo volvimos a reinsertar en el tubo y cerramos el tapón
4.Sacamos el test del envoltorio y agitamos el tubo
5.Rompemos la punta del tubo y depositamos unas gotas en el orificio de la tarjeta
6.Esperamos 5 min y observamos 5 min

Práctica 22. Sedimento urinario

Sedimento urinario                                                                                        13-2-2020

Objetivo
En esta práctica se pretende analizar  la orina macroscopicamente y microscopicamente para observar el sedimento urinario al microscopio
Fundamento 
Búsqueda de distintos elementos formes como leucocitos, cilindros, etc con diferente utilidad diagnostica
Material
-->Gradilla
--> Recipiente de boca ancha estéril
--> Tubos de centrifuga
--> Pipetas pasteur
--> Centrifuga
--> Microscopio
--> Tiras reactivas


Procedimiento
1.Observamos macroscopicamente la orina, anotando su turbidez, aspecto, color y pH mediante tiras reactivas

2.Tomamos muestras de orina y las colocamos en tubos de centrifuga, se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 min
3.Eliminamos le sobrenadante con una pipeta pasteur
4.Resuspendimos el sedimento y depositamos unas gotas sobre una placa
5.Observamos al microscopio


Resultados
1--> Muy turbia, con color, pH 5
2--> Turbia, colurica, pH 5
3--> Turbia, color normal, pH 5
4--> Turbia, color normal, pH 5,5
5--> Turbia, con sedimento, pH 7
6--> No muy turbia, color normal, pH 6

Práctica 21. Bilirrubina directa

Bilirrubina directa                                                                                                   6-2-2020

Objetivo
En esta práctica vamos a aprender a realizar la determinación cuantitativa de la bilirrubina directa
Fundamento
La bilirrubina se convierte en azobilirrubina mediante el ácido sulfanilico diazotado midiéndose fotometricamene. De las dos fracciones presentes en suero, bilirrubin-glucoronido y bilirrubina libre ligada a la albumina. solo la primera reacciona en medio acuoso precisando la segunda solubilizacion con dimetilsulfoxio para que reaccione. En la determinación de la bilirrubina indirecta se determina también la directa, correspondiendo el resultado a la bilirrubina total. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de bilirrubina presente en la muestra ensayada
Materiales
--> Gradilla
--> Tubos de ensayo
--> Micropipetas y puntas
--> Espectrofotometros
Reactivos
--> R1 Ácido sulfanilico
--> R2 Sodio nitrito
Procedimiento 
1. Encendemos el espectrofotometro
2.En el primer tubo depositamos 1,5ml de R1 y 100 µl de muestra
3.En el segundo tubo depositamos 1,5 ml de R1, 50 µl de R2 y 100 µl de suero control
4.En el tercer tubo depositamos 1,5ml de R1, 50 µl de R2 y 100µl muestra
5.Mezclamos e incubamos 5 min exactos
6.Medimos su absorbancia
Cálculos
Muestra --> 0,115
Patrón --> 0,147
Concentración de calibrador --> 0,72
0,115/0,147 x 0,72 = 0,56 mg/dL

Práctica 20. Bilirrubina total

Bilirrubina total                                                                                      6-2-2020

Objetivo
En esta práctica vamos a aprender la realizar la determinación cuantitativa de bilirrubina

Fundamento
La bilirrubina se convierte en azobilirrubina mediante el ácido sulfanilico diazotado midiendose fotometricamente. De las dos fracciones presentes en suero, bilirrubin-glucuronido y bilirrubina libre liagada a la albumina, solo la primera reacciona en medio acuoso precisando la segunda la solubilización con dimetilsulfoxido para que reaccione. En la determinacion de bilirrubina indirecta se determina tambien la directa, correspondiendo el resultado a la bilirrubina total. La intensidad del color formado es proporcional a la concentracion de bilirrubina presente en la muestra ensayada

Materiales
--> Gradilla
--> Tubos
--> Micropipetas y puntas
--> Espectrofotometro
Reactivos
--> R1 Ácido sulfanilico
--> R2 Sodio nitrito
--> Bilirrubin Cal


Procedimiento
1.Encendemos el espectrofotometro
2.En el primer tubo depositamos 1,5 ml de R1 y 100 µl de muestra
3.En el segundo tubo depositamos 1,5 ml de R1, 50 µl de R2 y 100 µl de suero control
4.En el tercer tubo depositamos 1,5ml de R1, 50 µl de R2 y 100 µl de muestra
5. Mezclamos e incubamos 5 min exactos a temperatura ambiente
6.Medimos en el espectrofotometro


Cálculos
Muestra --> 0,286
Patrón --> 0,336
Concentración de calibrador --> 1,17
0,286/ 0,336 x 1,17 = 0,995mg/dL

Práctica 19. Creatinina

Determinación cuantitativa de Creatinina                                                      30-1-20
Objetivo
En esta práctica vamos a aprender a realizar la determinación cuantitativa de creatinina.
Fundamento
El ensayo de la creatinina está basado en la reacción de la creatinina con el picrato de sodio descrito por Jaffe. La creatinina reacciona con el picrato alcalino formando un complejo rojizo. El intervalo de tiempo escogido para las lecturas permite eliminar gran parte de las interferencias conocidas del método. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de creatinina en la muestra ensayada.
Materiales
--> Micropipetas y puntas
--> Tubos
--> Gradilla
--> Cubetas
--> Espectrofotómetro
Reactivos
--> R1 Reactivo pícrico
--> R2 Reactivo alcalinizante
--> Creatinine cal


Procedimiento
1.Encendemos el espectrofotómetro
2.Preparamos el reactivo de trabajo, mezclando volúmenes iguales de R1 y R2
3.En el tubo del blanco, depositamos 1 ml de RT
4.En el tubo del patrón, depositamos 1 ml de RT y 100 µl de patrón
5.En el tubo de muestra, depositamos 1 ml de RT y 100 µl de muestra
6.Mezclamos y pusimos en marcha el cronómetro
7.Medimos la absorbancia a los 30 segundos y después a los 90 segundos


Resultados
0,007/0,003 x 2 = 4,6

Práctica 18. HDL colesterol

Determinación cuantitativa de HDL colesterol                                                           29-1-20
Objetivo
En esta práctica vamos a aprender a realizar la determinación cuantitativa del colesterol HDL
Fundamento
Las partículas de HDL son lipoproteinas de alta densidad que transportan el colesterol desde los tejidos del cuerpo hasta el hígado. Debido a que las HDL pueden retirar el colesterol de las arterias y transportarlo de vuelta al hígado para su excreción, se les conoce como el colesterol bueno.
Materiales 
-->  Micropipetas y puntas
-->  Cubetas
-->  Tubos
-->  Espectrofotómetro
-->  Gradilla
Reactivos
-->  R1
-->  R2
-->  HDL cal



Procedimiento
1.Encendemos el espectrofotómetro
2.En el tubo del blanco depositamos 300 µl de R1
3.En el tubo del patrón depositamos 300 µl de R1 y 3 µl de calibrador
4.En el tubo de muestra depositamos 300 µl de R1 y 3 µl de muestra
5.Mezclamos e incubamos 5 minutos a 37º
6.Leemos la absorbancia
7.Después de medir, añadimos 100 µl de R2 a cada uno de los 3 tubos
8.Mezclamos e incubamos 5 minutos a 37º y medimos la absorbancia
  

Resultados
No obtuvimos resultados coherentes ya que la cantidad presente en el tubo era insuficiente para ser leída en la cubeta

Práctica 17. Ácido urico

Determinación cuantitativa de ácido úrico                                                                   23-1-20

Objetivo
En esta práctica vamos a aprender a realizar la determinación cuantitativa de ácido úrico
Fundamento
El ácido úrico es oxidado por la uricasa a alantoina y peróxido de hidrógeno que en presencia de peroxisada, 4-aminofenazona y 2-4 Diclorofenol sulfonato forma un compuesto rosáceo. La intensidad de quinonamina roja es formada es proporcional a la concentración de ácido úrico presenta en la muestra ensayada
Materiales
--> Micropipetas y puntas
--> Tubos
--> Gradilla
--> Cubetas
--> Espectrofotómetro
Reactivos
--> R1 Tampón
--> R2 Encimas
--> Uric acid cal
Procedimiento
1.Encendemos el espectrofotómetro
2.Preparamos el RT disolviendo el contenido de R2 en R1
3.Depositamos 1 ml de RT en un tubo
4.En otro tubo, depositamos 1ml de RT y 25 µl de patrón
5.En otro tubo, depositamos 1 ml de RT y 25 µl de muestra
6.Mezclamos e incubamos a 37º 5 minutos
7.Leemos en el espetrofotómetro
Cálculos 
Patrón --> 0,167
Muestra --> 0,162
0,162/0,167 x 6 = 5,82

Práctica 16. Colesterol

Colesterol                                                                                                 8-1-20

Objetivo
En esta práctica vamos a realizar la determinación cuantitativa de colesterol
Fundamento 
El colesterol es una sustancia grasa presente en todas las células del organismo. El hígado produce naturalmente todo el colesterol que necesita para formar la membranas celulares y producir ciertas hormonas
Materiales
--> Micropipetas y puntas
--> Tubos
--> Gradilla
--> Cubetas
--> Espectrofotometro
Reactivos
--> R1 Tampon
--> R2 Enzimas
--> Cholesterol cal
Procedimiento
1.Encendemos el espectrofotometro
2.Preparamos el RT disolviendo el contenido de R2 en R1
3.En un tubo depositamos 1 ml de RT
4.En otro tubo depositamos 1 ml de RT y 10 µl de patrón
5.En otro tubo depositamos 1 ml de RT y 10 µl de muestra
6.Mezclamos e incubamos 5 min a 37º
7.Leemos su absorbancia en el espectrofotometro
Cálculos
Patrón --> 0,939
Muestra --> 0,356
0,356/0,393 x 200 = 181,17

Práctica 15. Trigliceridos

Determinación cuantitativa de triglicéridos                                                   8-1-20

Objetivo
En esta práctica vamos a realizar la determinación cuantitativa de triglicéridos
Fundamento
Los triglicéridos son grasas que suministran energía a la célula. Al igual que el colesterol son transportados a las células por las lipoproteinas en la sangre. Una dieta alta en grasas saturadas o carbohidratos pueden elevar sus niveles, pero también aumenta debido a disfunciones hepáticas, diabetes...
Materiales
--> Micropipetas y puntas
--> Tubos
--> Gradilla
--> Cubetas de espectrofotometro


Reactivos
--> R1Tampon
--> R2 Enzimas
--> Calibrador
--> Agua destilada


Procedimiento
1.Encendemos el espectrofotometro y ponemos la longitud de onda a 505 nm
2.Preparamos el RT, disolviendo el contenido de R2 en el frasco de R1
3.En un tubo depositamos 1 ml de RT, este sera el blanco
4.En otro tubo depositamos 1 ml de RT y 10 µl de patrón


5.En otro tubo depositamos 1 ml de RT y 10 µl de muestra


6.Mezclamos e incubamos 5 min a 37º


7.Leemos su absorbancia en el espectrofotometro

Cálculos
Patrón--> 0,288
Muestra --> 0,277
0,277/0,288 x 200 = 192,36

Práctica 14. Inmunodotting

Inmunodotting                                                                                                   18-12-19

Objetivo
En esta práctica vamos a realizar la técnica de inmunodotting para hepatitis autoinmunes
Fundamento
Se basa en el principio del Enzimoinmunoanalisis. Cada tira del test esta compuesta por una membrana fijada sobre un soporte plastico. En dicha membrana se han dispensado directamente los distintos Ag.
Materiales
--> Bandeja de incubación
--> Papel absorbente
--> Pipetas de 2 ml
--> Micropipetas y puntas
Reactivos
--> Tampón de lavado concentrado
--> Tiras dot
--> Tampón de dilución
--> Conjugado
--> Sustrato
Procedimiento
1.Colocamos una tira en un canal de la bandeja de incubación con los puntos azules hacia arriba
2.Añadimos 2ml de tampón de lavado en cada canal usado
3.Incubamos 10 min en agitación
4.Eliminamos el liquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja y secamos el borde de la bandeja con papel absorbente
5.Añadir 1,5 ml de tampón de dilucion en cada uno de los canales utilizados
6.Añadimos 10 µl de muestra del paciente por canal, incubamos 30 minutos en agitación
7.Eliminamos el liquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja y secamos el borde
8.Lavamos dos veces cada canal utilizado con 1,5 ml de tampon de lavado, agitando durante el lavado. Eliminamos el liquido de los canales invierto la bandeja
9.Añadimos 1,5 ml de conjugado en cada canal e incubamos 30 minutos en agitacion
10.Eliminamos el líquidos de los canales invirtiendo la bandeja
11.Lavamos tres veces con 1,5 ml de tampon de lavado
12.Añadimos 1,5 ml de sustrato e incubamos 10 min
13.Eliminamos el liquido
14.Lavamos una ultima vez con 1,5ml de tampon de lavado
15.Extraemos las tiras de los canales y las dejamos secar en un papel absorbente
16.Colocamos la tira junto a la hoja de interpretación
17.Comparamos el punto correspondiente a cada Ag especifico con el punto de control negativo

Práctica 13. Hemoglobina glicosilada

Hemoglobina glicosilada                                                                              12-12-19

Objetivo
En esta práctica vamos a realizar la determinación de hemoglobina glicosilada por cromatografia en columna
Fundamento
Se basa en mezclar una alícuota de sangre completa con un agente hemolizante, se obtiene la lisis de los hematíes, la liberación de la hemoglobina contenida en ellos y la eliminación de la fracción lábil
Materiales 
--> Tubos de ensayo
--> Eppendorf
--> Gradillas
--> Micropipetas y puntas
Reactivos
--> R1: Biftalato de potasio
--> R2: Tampón 42 mmol/L
--> R3:Tampón 50 mmol/L
--> Columna de cromatografia


Muestra
--> Sangre completa con EDTA
Procedimiento
1.Pipeteamos en un eppendorf 50 µl de sangre y 450 µl de reactivo. Esperamos 10 min
2.Quitamos el tapón superior de la columna y rompemos la espita inferior y retiramos el liquido de la columna
3.Pipeteamos 50 µl del hemolizado en el interior de la columna y esperamos 3 min y descartamos el eventual eluido
4.Pipeteamos 2 ml del reactivo 2 en el interior de la columna y descartamos el eluido
5.Colocamos la columna dentro de un tubo y pipeteamos 2 ml del reactivo 3 y recojemos el eluido
6.Mezclamos el eluido obtenido y leemos su absorbancia en el espectrofotometro
7.Pipeteamos en un tubo 100µl de hemolizado y 12 ml de agua destilada, mezclamos y leemos su absorbancia



Cálculos y resultado
Total --> 1,036
Eluido --> 0,116
0,116/ (3 x 1,036) = 3,73

Práctica 12. Inmunodifusión radial

Inmunodifusión radial                                                                                          4-12-19

Objetivo
En esta práctica vamos a realizar la cuantificación de una proteína sanguínea por inmunodifusion radial

Fundamento
La inmunodifusion radial es una técnica cuantitativa muy sensible que se utiliza a menudo para detectar los niveles de determinadas proteínas sanguíneas de los pacientes.

Materiales
--> Micropipetas y puntas
--> Placa de petri pequeña
--> 10 cortadores de pocillos
--> Baño termostatico
--> Microondas
--> Probeta
--> Matraz aforado
--> Estufa de incubación
Reactivos 
--> Solución de Ac
--> Solución de Ag estandar
--> Agarosa
--> Tampon en polvo
--> Proteína de concentración desconocida
Procedimiento
1.Preparamos el tampon, vertiendo 200 ml de agua destilada en una probeta y luego vertimos el componente D y mezclamos bien con una varilla
2.Preparamos la agarosa, vertiendo 150 ml de tampon y vertimos el contenido del componente C. Lo metimos en el microondas y cuando ya estaba transparente lo metimos en el baño a 50º
3.Cogimos 26 ml en un recipiente y le añadimos el componente A
4.Preparamos la batería de dilucion. Depositamos 50 µl de tampon en cada tubo, en el tubo 1 depositamos 50µl del tubo E, homogeneizados y pasamos 50 µl al tubo de 2 y asi sucesivamente hasta desechar 50 µl del ultimo tubo
5.Pipeteamos 3000 µl de agarosa en la placa de petri y la dejamos solidificar
6.Realizamos los pocillos en la placa
7.Depositamos 5 µl del Ag en el pocillo central
8.Depositamos 5 µl de cada tubo en el resto de pocillos
9.Tapamos la placa y la colocamos en la cámara húmeda durante 1 semana
Resultados
-Pocillo 1--> 400mm --> Concentración --> 2mg/ml
-Pocillo 2--> 225 mm --> Concentración --> 1 mg/ml
-Pocillo 4--> 64mm --> Concentración --> 0,25 mg/ml
-Pocillo 5 --> 49 mm --> Concentración --> 0,125mg/ml
-Pocillo muestra --> 13 mm


Realizamos el mismo procedimiento solo que con placas comerciales, en las que solo teníamos que aplicar la muestra y esperar unos días para la lectura

Práctica 11. Electroforesis

Electroforesis                                                                                                         27-11-19

Objetivo
-En esta práctica vamos a realizar mediante técnicas electroquímicas la identificación y cuantificación de proteínas.

Fundamento
-Las proteínas que son moléculas anfóteras en medio básico adquieren carga global negativa que hace que migren del cátodo hacia el ánodo cuando son sometidas a un proceso electroforetico. Tras la migración obtenemos 5 fracciones: Albumina, alfa 1-globulinas, alfa 2-globulinas, beta-globulinas y gamma-globulinas

Materiales
--> Alimentador y cubeta de electroforesis
--> Aplicador
--> Laminas de Mylar
--> Papel de filtro
--> Tiras de acetato de celulosa



Reactivos
--> Solución tampon
--> Colorante rojo ponceau
--> Decolorante rojo ponceau
--> Solución transparentadora
--> Solución disolvente


Procedimiento
1.Preparamos el tampon añadiendo 100mg de tris hipurato a 1L de agua
2.Preparación del decolorante, disolviendo ácido cítrico en polvo en 1L de agua destilada, vertimos 500ml en dos cubetas
3.Introdujimos cada grupo una tira en la cubeta con el tampon
4.Movimos la cubeta durante 12 minutos
5.Preparamos la cámara de electroforesis
6.Secamos las tiras colocandolas primero sobre un papel y poniéndole otro encima para quitarle los restos de metanol, despues las colocamos sobre el puente con la cara absorbente hacia arriba y colocamos el puente en la camara de electroforesis
7.Aplicamos la muestra en la tira utilizando un aplicador durante 10 segundos
8.Ajustamos el tiempo y el voltaje (200 V durante 30 min)
9.Tras ese tiempo extraemos las tiras y procedemos la tincion
10.Teñimos la tira con Rojo de Ponceau durante 5 min
11. Pasado ese tiempo, pasamos las tiras a la solución decolorante de ácido cítrico y aplicamos tres baños seguidos
12.Por ultimo pasamos la tira a la solución transparentizadora durante 1 min agitando
13.Colocamos la tira en un Mylar film y eliminamos el exceso de solución tranparentizadora con una varilla de vidrio

Cálculos
(92 x 100)/ 223 = 41,26%

Resultados
Al medir nos dio un valor de 223 que corresponde a la cantidad que hay por debajo de todos los picos
Después nos dio el primer valor (92) el cual corresponde a la albumina