Práctica 10. Método Biuret

20-11-19

Objetivo
En esta práctica vamos a realizar una determinación de proteínas totales por el método de biuret

Fundamento
En medio alcalino, las proteínas dan un intenso color violeta azulado en presencia de sales de cobre; contiene yoduro como antioxidante. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de proteica total en la muestra ensayada

Materiales y reactivos
-->Gradillas
-->Tubos de ensayo
-->Espectrofotometro
-->Micropipetas y puntas
-->R(Biuret)
-->Protein cal
-->Muestra (Suero)

Procedimiento
1.Encendimos el espectrofotometro y seleccionamos la longitud de onda de 540nm
2.Preparamos el blanco, depositando 1ml de R
3.Preparamos en otro tubo el patrón, depositando 1 ml de R y 25 µl de protein cal
4.Preparamos el tubo de la muestra depositando 1 ml de R y 25 µl de la muestra.
5.Esperamos 10 min
6.Ajustamos el blanco en el espectrofotometro
7.Medimos el patrón
8.Medimos la muestra

Resultados
Patrón --> 0,623
Muestra Madeleine -->0,372
Muestra Ines --> 0,302
Mi muestra --> 0,342 --> 0,342/0,623 x 7 --> 3,8

Práctica 9. Hemoglobina glicosilada

14-11-19

Objetivo
En esta práctica vamos a realizar la medida de hemoglobina glicosilada utilizando Nyco Card READER II

Fundamento
La hemoglobina glicosilada es una porción de la hemoglobina Hb A1c, que se encuentra unida de forma irreversible a la glucosa mediante enlaces covalentes. Se forma dentro de los hematíes siendo su cantidad proporcional a los niveles de glucosa y permanecen en ellos hasta que son destruidos.

Materiales y reactivos
-->Densitometro Nyco Card
-->Gradilla
-->Micropipeta y puntas
-->Membrana TD con forma circular
-->Tubo de ensayo con sangre total
-->R1
-->R2

Procedimiento
1.Pusimos en marcha el densitometro encendiendolo y ajustando el blanco
2.En tubo lleno con R1 depositamos 5 µl de sangre y homogeneizamos con la pipeta
3.Lo dejamos reposar 2 min y medio
4.Homogeneizamos de nuevo y depositamos 25µl de la mezcla sobre el TD sin llegar a tocarlo
5.Esperamos 10 segundos
6.Añadimos 25 µl del R2(solución de lavado) y esperamos de nuevo 10 segundos
7.Realizamos la lectura en el densitometro situando el lápiz lector sobre el agujero del test y presionando

    

Resultado
Nos dio como resultado 6,6%

Práctica 8.Separación de una mezcla de aminoácidos por cromatografía en capa fina

Separación de una mezcla de aa por cromatografia en capa fina                                24-10-19

-Objetivo

En esta práctica vamos a realizar una separación e identificación de los aa triptofano, alanina, valina y arginina presentes en una muestra mediante una cromatografía de capa fina ascendente

-Fundamento

Esta cromatografía es una técnica de separación e identificación de sustancias químicas disueltas en un disolvente (fase móvil) que se mueve sobre una capa delgada de un absorbente idóneo (fase estacionaria).

-Materiales y reactivos 

--> Láminas de gel de celulosa

--> Cubeta o tarro de cristal

--> Micropipeta y puntas

--> Atomizador

-->Butanol

--> Agua

-->Acetona

-->Nihidrina

-Procedimiento

a) Preparación de laminas de gel de celulosa

1.Cogimos unas láminas de gel de celulosa de 5x20 y las cortamos por la mitad, ya que la medida que necesitábamos era de 5x10

2.Marcamos la lámina con un lápiz a 1,5 cm del borde una linea

3.Dibujamos dos círculos sobre esa linea aproximadamente a 1cm de distancia de los bordes

b)Preparación del disolvente

1.Mezclamos 200 ml de butanol mas 50 ml de agua mas 50 ml de acetona y mas 50 ml de ácido acético

2.Colocamos el disolvente en un vaso de precipitado a una altura de 1 cm aproximadamente, un poco antes de llegar a la linea previamente marcada

c)Preparación del patrón y la muestra

1.Depositamos 50 µl de patrón en uno de los círculos previamente dibujados

2.Depositamos entre 2 y 3 µl de muestra en el otro circulo

3.Lo metimos en la estufa unos minutos

4.Lo colocamos en el vaso de precipitado que contiene el disolvente en posición vertical 

5.Esperamos 20 min

d)Preparación de la disolución reveladora

1.Pesamos 0,2gr de nihidrina en la balanza

2.Lo depositamos en una probeta con 100ml de acetona y mezclamos

3.Transcurridos los 20 min marcamos en la lamina hasta donde había ascendido el disolvente con un lápiz

4.Sacamos las láminas a la calle y las pulverizamos con el atomizador

5.Las metimos en la estufa a 110º

-Cálculos y resultados

Rf= distancia recorrida por el compuesto desde el origen/ distancia recorrida por el eluyente desde el origen

Medidas

-Distancia recorrida eluyente--> 3cm

-Distancia recorrida marca 1 --> 1cm

-Distancia recorrida marca 2 --> 2,2 cm

-Distancia recorrida marca 3--> 2,6cm

Rf=1/3= 0,33 --> Arginina

Rf=2,2/3= 0,73--> Ac.Glutaminico

Rf=2,6/3= 0,86--> Felinanalina

Práctica 7. Glucosa-HK

Determinación cuantitativa de glucosa.Hexoquinasa                      23-10-19

-Objetivo
En esta práctica vamos a obtener una medida cuantitativa de glucosa utilizando la técnica hexoquinasa

-Fundamento 
La hexoquinasa cataliza la fosforilación de la glucosa por ATP a glucosa-6-fosfato. La glucosa-6-fosfato originada es reducida a 6-fosfogluconato en presencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa con reducción paralela de NAD a NADH+. El aumento en la concentración de NADH en el medio es proporcional a la concentración de glucosa presente en la muestra ensayada

-Materiales y reactivos
--> Micropipeta y puntas
--> Contenedor de desechos
--> Gradilla
--> Tubos de ensayo
--> Baño termostatico
--> Espectrofotometro
--> Cubetas de espectrofotometria
--> R1 y R2 para formar RT
--> Muestra de orina
--> Glucosa CAL

-Procedimiento
1.Preparamos el RT disolviendo el contenido del R2 en el frasco de R1 como en la práctica anterior
2.Preparamos un blanco y un patrón por mesa, para el blanco depositamos 1 ml de RT en un tubo de ensayo, y para el patrón depositamos 1ml de RT y 10 µl  de glucosa CAL.
3.Colocamos el blanco 5 min en el baño termostatico
4.Pasamos el tiempo ajustamos el blanco en el espectrofotometro
5.Colocamos el patron en el baño durante 5 min
6.Pasado el tiempo realizamos la lectura en el espectrofotometro
7.Realizamos una muestra cada uno, depositando en un tubo 1ml de RT y 10 µl  de orina.
8.Colocamos la muestra en el baño 5 min
9.Pasado ese tiempo medimos su absorbancia en el espectrofotometro

-Cálculos
Absorbancia de la muestra = 0,684
0,684/0,305 x 100 = 222

-Resultados 
222mg/dL de glucosa en la muestra de orina

Práctica 6.Glucosa-TR

Determinación cuantitativa de glucosa                          17-10-19

-Objetivo
En esta práctica de glucosa oxidasa vamos a medir la cantidad de glucosa en suero sanguíneo.

-Fundamento
La glucosa oxidasa cataliza la oxidación de glucosa a ácido glucónico. El H2O2 producido se detecta mediante un aceptor cromogenico de oxigeno, fenol-ampirona en presencia de peroxidasa

-Materiales y reactivos
--> Gradillas
--> Micropipetas y puntas
--> Contenedor de desechos
--> Tubos de ensayo
--> Tampón --> R1
--> Enzimas--> R2
--> Glucosa CAL

-Procedimiento
1.Preparamos el reactivo de trabajo disolviendo el contenido del R2 en un frasco de R1, lo tapamos y mezclamos de forma suave
2.Realizamos un blanco y un patrón por mesa, depositando en el tubo del blanco 1ml de RT y en el tubo del patrón 1 ml de RT y 10 µl de patrón
3.Preparamos una muestra cada uno, depositando en el tubo de muestra 1 ml de RT y 10 µl de muestra, en este caso de suero sanguíneo, al poco tiempo ya se empezaba a observar el color
4.Tapamos los tubos y los colocamos en el baño termostatico durante 10 min
5.Pasamos a leer la absorbancia en el espectrofotometro
6.Primero ajustamos el blanco
7.Medimos el patrón
8.Medimos la absorbancia de nuestra muestra

Práctica 5. Turbidimetria

Cuantificación de proteínas en orina con ácido sulfosalicilico por turbidimetria   14-10-19

-Objetivo
Aprender la técnica de turbidimetria, que es una variante de la espectrofotometria de dispersión

-Fundamento 
La adición de ácido sulfosalicilico a una solución de proteínas actúa sobre estas, dando lugar a la aparición de un fino precipitado en suspensión. Vamos a cuantificar la concentración de proteínas presentes en una muestra de orina
-Materiales
--> Gradilla
--> 4 tubos
--> Micropipeta 50µl
--> Suero salino fisiologico
--> Proteínas
--> Pipeta de 10 ml
--> Prepipeta
--> Cubeta de espectrofotometria
--> Albumina bovina

-Procedimiento
1.Colocamos los 4 tubos en la gradilla
2.Añadimos 10 ml de SSF a cada tubo
3.Quitamos 50µl al primer tubo (D1)
4.Quitamos 100µl al segundo tubo(D2)
5.Quitamos 200 µl al tercer tubo(D3)
6.Quitamos 400 µl al cuarto tubo(D4)
7.Añadimos a cada tubo la misma cantidad quitada de proteínas

8.Tapamos los tubos y los guardamos
9.Realizamos la dilución del ácido sulfosalicilico, añadiendo 3 gr del ácido a un matraz y completando con agua destilada hasta enrasar 100 ml

10. Dos días después preparamos los dos blancos y cuatro tubos mas de patrón y un ultimo tubo como muestra problema
11. Disponemos en una gradilla los tubos y los rotulamos
-Tubo BR --> 0,5 ml de SSF + 2 ml de ácido sulfosalicilico
-Tubo P1 --> 0,5 ml de D1 + 2ml de ácido sulfosalicilico
-Tubo P2 --> 0,5 ml de D2 + 2 ml de ácido sulfosalicilico
-Tubo P3 --> 0,5 ml de D3 + 2 ml de ácido sulfosalicilico
-Tubo P4 --> 0,5 ml de D4 + 2 ml de ácido sulfosalicilico
-Tubo BM --> 2 ml de SSF + 0,5 ml de orina + 2 ml de la muestra problema

12.Ajustamos a cero con el BR el espectrofotometro
13. Medimos los tubos P1, P2, P3 y P4
14. Ajustamos a 0 de nuevo con el BM
15.Medimos la absorbancia de la muestra problema
-Resultados
-P1 --> 1,605
-P2 --> 1,105
-P3 --> 0,240
-P4 --> 0,072

Práctica 4. Medición con el refractómero

Medición con el refractometro  14/10/19

-Objetivo 
Aprender a utilizar el refractometro manual y entender el fenomeno de la refracción.
-Fundamento
El ángulo de refracción de la luz es un liquido cualquiera que viene dado por la relación existente entre la velocidad de la luz en el vacío y la velocidad de la luz en el liquido en cuestion
-Materiales
--> Refractometro
--> Eppendorf con suero
--> Gradilla
--> Pipeta pasteur
--> Agua destilada

-Procedimiento
1.Limpiamos el refractometro con un papel
2.Añadimos una gota de agua destilada
3.Calibramos el refractometro
4.Secamos con papel
5.Añadimos una gota de la muestra de suero
6.Medimos las proteínas y la densidad

-Resultados
--> Densidad del suero 1,3510
--> Proteínas 8,3

Práctica 2. Medida de la absorbancia

Medida de absorbancia       25-9-19

-Objetivo
En esta práctica vamos a medir la absorbancia de cada tubo de la batería de diluciones de la práctica anterior con el espectrofotometro


-Materiales
--> Batería de diluciones
--> Espectrofotometro
--> Cubetas
--> Portacubetas

-Procedimiento
1.Calibramos en el espectrofotometro
2.Comenzamos midiendo la batería de diluciones del colorante azul y después la roja
3.Llenamos una cubeta por cada tubo
4.Limpiamos las cubetas con papel antes de ponerlas en el espectrofotometro
5.Medimos todos los tubos


-Resultados 
Batería azul
Tubo DM--> 1,047
Tubo D1 --> 0,538
Tubo D2 --> 0,256
Tubo D3 --> 0,125
Tubo D4 --> 0,073
Batería roja
Tubo DM --> 1,898
Tubo D1 --> 0,623
Tubo D2 --> 0,203
Tubo D3 --> 0,078

-Este día medimos la absorbancia de dos muestras de concentración desconocida
--> Absorbancia de colorante rojo desconocido: 152
--> Absorbancia del colorante azul desconocido : 1.150

Práctica 1.Baterías de dilución seriadas

Batería de diluciones    19-9-19

-Objetivo
Realizar una bateria de diluciones y comprender el funcionamiento del espectrofotometro de absorción
-Materiales y reactivos:
→Matraz erlenmeyer con cromógeno 1, de concentración 800mg/dL
→Matraz erlenmeyer con cromógeno 2; de concentración 600mg/dL
→Agua destilada
→Pipetas manuales
→Tubos de ensayo de 10 ml
→Cubetas de espectrofotometría
→Espectofotómetro de absorción
→Gradilla



 Cálculos: 
a) Batería de dilución que consta de 5 tubos con 4ml cada uno y factor de dilución 1/2.
Vp=Vf/x-1→ Vp=4/2-1 →Vp= 4 ml 
b) Batería de dilución que consta de 4 tubos con 3 ml cada uno y factor de dilución 1/3
Vp=Vf/x-1 →Vp= 3/3-1 →Vp= 1,5ml 

Procedimiento 
a) 
1.Colocamos los 5 tubos en las gradillas y les añadimos 4 ml de agua destilada a cada uno, menos al primero
2. Añadimos al primer tubo 8 ml de colorante azul 
3. Pipeteamos 4 ml del primer tubo al segundo tubo resuspendiendo ,y así sucesivamente hasta el último tubo
4. Desechamos 4 ml del último tubo 
b) 
1.Colocamos los 4 tubos en las gradillas y les añadimos 3 ml de agua destilada a cada uno, menos al primero
2. Añadimos al primer tubo 3 ml de colorante rojo
3. Pipeteamos 1,5 ml del primer tubo al segundo tubo resuspendiendo y asi sucesivamente hasta el último tubo
4.Desechamos 1,5 ml del último tubo