Práctica 13. Hemoglobina glicosilada

Hemoglobina glicosilada                                                                              12-12-19

Objetivo
En esta práctica vamos a realizar la determinación de hemoglobina glicosilada por cromatografia en columna
Fundamento
Se basa en mezclar una alícuota de sangre completa con un agente hemolizante, se obtiene la lisis de los hematíes, la liberación de la hemoglobina contenida en ellos y la eliminación de la fracción lábil
Materiales 
--> Tubos de ensayo
--> Eppendorf
--> Gradillas
--> Micropipetas y puntas
Reactivos
--> R1: Biftalato de potasio
--> R2: Tampón 42 mmol/L
--> R3:Tampón 50 mmol/L
--> Columna de cromatografia


Muestra
--> Sangre completa con EDTA
Procedimiento
1.Pipeteamos en un eppendorf 50 µl de sangre y 450 µl de reactivo. Esperamos 10 min
2.Quitamos el tapón superior de la columna y rompemos la espita inferior y retiramos el liquido de la columna
3.Pipeteamos 50 µl del hemolizado en el interior de la columna y esperamos 3 min y descartamos el eventual eluido
4.Pipeteamos 2 ml del reactivo 2 en el interior de la columna y descartamos el eluido
5.Colocamos la columna dentro de un tubo y pipeteamos 2 ml del reactivo 3 y recojemos el eluido
6.Mezclamos el eluido obtenido y leemos su absorbancia en el espectrofotometro
7.Pipeteamos en un tubo 100µl de hemolizado y 12 ml de agua destilada, mezclamos y leemos su absorbancia



Cálculos y resultado
Total --> 1,036
Eluido --> 0,116
0,116/ (3 x 1,036) = 3,73

Práctica 12. Inmunodifusión radial

Inmunodifusión radial                                                                                          4-12-19

Objetivo
En esta práctica vamos a realizar la cuantificación de una proteína sanguínea por inmunodifusion radial

Fundamento
La inmunodifusion radial es una técnica cuantitativa muy sensible que se utiliza a menudo para detectar los niveles de determinadas proteínas sanguíneas de los pacientes.

Materiales
--> Micropipetas y puntas
--> Placa de petri pequeña
--> 10 cortadores de pocillos
--> Baño termostatico
--> Microondas
--> Probeta
--> Matraz aforado
--> Estufa de incubación
Reactivos 
--> Solución de Ac
--> Solución de Ag estandar
--> Agarosa
--> Tampon en polvo
--> Proteína de concentración desconocida
Procedimiento
1.Preparamos el tampon, vertiendo 200 ml de agua destilada en una probeta y luego vertimos el componente D y mezclamos bien con una varilla
2.Preparamos la agarosa, vertiendo 150 ml de tampon y vertimos el contenido del componente C. Lo metimos en el microondas y cuando ya estaba transparente lo metimos en el baño a 50º
3.Cogimos 26 ml en un recipiente y le añadimos el componente A
4.Preparamos la batería de dilucion. Depositamos 50 µl de tampon en cada tubo, en el tubo 1 depositamos 50µl del tubo E, homogeneizados y pasamos 50 µl al tubo de 2 y asi sucesivamente hasta desechar 50 µl del ultimo tubo
5.Pipeteamos 3000 µl de agarosa en la placa de petri y la dejamos solidificar
6.Realizamos los pocillos en la placa
7.Depositamos 5 µl del Ag en el pocillo central
8.Depositamos 5 µl de cada tubo en el resto de pocillos
9.Tapamos la placa y la colocamos en la cámara húmeda durante 1 semana
Resultados
-Pocillo 1--> 400mm --> Concentración --> 2mg/ml
-Pocillo 2--> 225 mm --> Concentración --> 1 mg/ml
-Pocillo 4--> 64mm --> Concentración --> 0,25 mg/ml
-Pocillo 5 --> 49 mm --> Concentración --> 0,125mg/ml
-Pocillo muestra --> 13 mm


Realizamos el mismo procedimiento solo que con placas comerciales, en las que solo teníamos que aplicar la muestra y esperar unos días para la lectura

Práctica 11. Electroforesis

Electroforesis                                                                                                         27-11-19

Objetivo
-En esta práctica vamos a realizar mediante técnicas electroquímicas la identificación y cuantificación de proteínas.

Fundamento
-Las proteínas que son moléculas anfóteras en medio básico adquieren carga global negativa que hace que migren del cátodo hacia el ánodo cuando son sometidas a un proceso electroforetico. Tras la migración obtenemos 5 fracciones: Albumina, alfa 1-globulinas, alfa 2-globulinas, beta-globulinas y gamma-globulinas

Materiales
--> Alimentador y cubeta de electroforesis
--> Aplicador
--> Laminas de Mylar
--> Papel de filtro
--> Tiras de acetato de celulosa



Reactivos
--> Solución tampon
--> Colorante rojo ponceau
--> Decolorante rojo ponceau
--> Solución transparentadora
--> Solución disolvente


Procedimiento
1.Preparamos el tampon añadiendo 100mg de tris hipurato a 1L de agua
2.Preparación del decolorante, disolviendo ácido cítrico en polvo en 1L de agua destilada, vertimos 500ml en dos cubetas
3.Introdujimos cada grupo una tira en la cubeta con el tampon
4.Movimos la cubeta durante 12 minutos
5.Preparamos la cámara de electroforesis
6.Secamos las tiras colocandolas primero sobre un papel y poniéndole otro encima para quitarle los restos de metanol, despues las colocamos sobre el puente con la cara absorbente hacia arriba y colocamos el puente en la camara de electroforesis
7.Aplicamos la muestra en la tira utilizando un aplicador durante 10 segundos
8.Ajustamos el tiempo y el voltaje (200 V durante 30 min)
9.Tras ese tiempo extraemos las tiras y procedemos la tincion
10.Teñimos la tira con Rojo de Ponceau durante 5 min
11. Pasado ese tiempo, pasamos las tiras a la solución decolorante de ácido cítrico y aplicamos tres baños seguidos
12.Por ultimo pasamos la tira a la solución transparentizadora durante 1 min agitando
13.Colocamos la tira en un Mylar film y eliminamos el exceso de solución tranparentizadora con una varilla de vidrio

Cálculos
(92 x 100)/ 223 = 41,26%

Resultados
Al medir nos dio un valor de 223 que corresponde a la cantidad que hay por debajo de todos los picos
Después nos dio el primer valor (92) el cual corresponde a la albumina

Práctica 10. Método Biuret

20-11-19

Objetivo
En esta práctica vamos a realizar una determinación de proteínas totales por el método de biuret

Fundamento
En medio alcalino, las proteínas dan un intenso color violeta azulado en presencia de sales de cobre; contiene yoduro como antioxidante. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de proteica total en la muestra ensayada

Materiales y reactivos
-->Gradillas
-->Tubos de ensayo
-->Espectrofotometro
-->Micropipetas y puntas
-->R(Biuret)
-->Protein cal
-->Muestra (Suero)

Procedimiento
1.Encendimos el espectrofotometro y seleccionamos la longitud de onda de 540nm
2.Preparamos el blanco, depositando 1ml de R
3.Preparamos en otro tubo el patrón, depositando 1 ml de R y 25 µl de protein cal
4.Preparamos el tubo de la muestra depositando 1 ml de R y 25 µl de la muestra.
5.Esperamos 10 min
6.Ajustamos el blanco en el espectrofotometro
7.Medimos el patrón
8.Medimos la muestra

Resultados
Patrón --> 0,623
Muestra Madeleine -->0,372
Muestra Ines --> 0,302
Mi muestra --> 0,342 --> 0,342/0,623 x 7 --> 3,8

Práctica 9. Hemoglobina glicosilada

14-11-19

Objetivo
En esta práctica vamos a realizar la medida de hemoglobina glicosilada utilizando Nyco Card READER II

Fundamento
La hemoglobina glicosilada es una porción de la hemoglobina Hb A1c, que se encuentra unida de forma irreversible a la glucosa mediante enlaces covalentes. Se forma dentro de los hematíes siendo su cantidad proporcional a los niveles de glucosa y permanecen en ellos hasta que son destruidos.

Materiales y reactivos
-->Densitometro Nyco Card
-->Gradilla
-->Micropipeta y puntas
-->Membrana TD con forma circular
-->Tubo de ensayo con sangre total
-->R1
-->R2

Procedimiento
1.Pusimos en marcha el densitometro encendiendolo y ajustando el blanco
2.En tubo lleno con R1 depositamos 5 µl de sangre y homogeneizamos con la pipeta
3.Lo dejamos reposar 2 min y medio
4.Homogeneizamos de nuevo y depositamos 25µl de la mezcla sobre el TD sin llegar a tocarlo
5.Esperamos 10 segundos
6.Añadimos 25 µl del R2(solución de lavado) y esperamos de nuevo 10 segundos
7.Realizamos la lectura en el densitometro situando el lápiz lector sobre el agujero del test y presionando

    

Resultado
Nos dio como resultado 6,6%

Práctica 8.Separación de una mezcla de aminoácidos por cromatografía en capa fina

Separación de una mezcla de aa por cromatografia en capa fina                                24-10-19

-Objetivo

En esta práctica vamos a realizar una separación e identificación de los aa triptofano, alanina, valina y arginina presentes en una muestra mediante una cromatografía de capa fina ascendente

-Fundamento

Esta cromatografía es una técnica de separación e identificación de sustancias químicas disueltas en un disolvente (fase móvil) que se mueve sobre una capa delgada de un absorbente idóneo (fase estacionaria).

-Materiales y reactivos 

--> Láminas de gel de celulosa

--> Cubeta o tarro de cristal

--> Micropipeta y puntas

--> Atomizador

-->Butanol

--> Agua

-->Acetona

-->Nihidrina

-Procedimiento

a) Preparación de laminas de gel de celulosa

1.Cogimos unas láminas de gel de celulosa de 5x20 y las cortamos por la mitad, ya que la medida que necesitábamos era de 5x10

2.Marcamos la lámina con un lápiz a 1,5 cm del borde una linea

3.Dibujamos dos círculos sobre esa linea aproximadamente a 1cm de distancia de los bordes

b)Preparación del disolvente

1.Mezclamos 200 ml de butanol mas 50 ml de agua mas 50 ml de acetona y mas 50 ml de ácido acético

2.Colocamos el disolvente en un vaso de precipitado a una altura de 1 cm aproximadamente, un poco antes de llegar a la linea previamente marcada

c)Preparación del patrón y la muestra

1.Depositamos 50 µl de patrón en uno de los círculos previamente dibujados

2.Depositamos entre 2 y 3 µl de muestra en el otro circulo

3.Lo metimos en la estufa unos minutos

4.Lo colocamos en el vaso de precipitado que contiene el disolvente en posición vertical 

5.Esperamos 20 min

d)Preparación de la disolución reveladora

1.Pesamos 0,2gr de nihidrina en la balanza

2.Lo depositamos en una probeta con 100ml de acetona y mezclamos

3.Transcurridos los 20 min marcamos en la lamina hasta donde había ascendido el disolvente con un lápiz

4.Sacamos las láminas a la calle y las pulverizamos con el atomizador

5.Las metimos en la estufa a 110º

-Cálculos y resultados

Rf= distancia recorrida por el compuesto desde el origen/ distancia recorrida por el eluyente desde el origen

Medidas

-Distancia recorrida eluyente--> 3cm

-Distancia recorrida marca 1 --> 1cm

-Distancia recorrida marca 2 --> 2,2 cm

-Distancia recorrida marca 3--> 2,6cm

Rf=1/3= 0,33 --> Arginina

Rf=2,2/3= 0,73--> Ac.Glutaminico

Rf=2,6/3= 0,86--> Felinanalina

Práctica 7. Glucosa-HK

Determinación cuantitativa de glucosa.Hexoquinasa                      23-10-19

-Objetivo
En esta práctica vamos a obtener una medida cuantitativa de glucosa utilizando la técnica hexoquinasa

-Fundamento 
La hexoquinasa cataliza la fosforilación de la glucosa por ATP a glucosa-6-fosfato. La glucosa-6-fosfato originada es reducida a 6-fosfogluconato en presencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa con reducción paralela de NAD a NADH+. El aumento en la concentración de NADH en el medio es proporcional a la concentración de glucosa presente en la muestra ensayada

-Materiales y reactivos
--> Micropipeta y puntas
--> Contenedor de desechos
--> Gradilla
--> Tubos de ensayo
--> Baño termostatico
--> Espectrofotometro
--> Cubetas de espectrofotometria
--> R1 y R2 para formar RT
--> Muestra de orina
--> Glucosa CAL

-Procedimiento
1.Preparamos el RT disolviendo el contenido del R2 en el frasco de R1 como en la práctica anterior
2.Preparamos un blanco y un patrón por mesa, para el blanco depositamos 1 ml de RT en un tubo de ensayo, y para el patrón depositamos 1ml de RT y 10 µl  de glucosa CAL.
3.Colocamos el blanco 5 min en el baño termostatico
4.Pasamos el tiempo ajustamos el blanco en el espectrofotometro
5.Colocamos el patron en el baño durante 5 min
6.Pasado el tiempo realizamos la lectura en el espectrofotometro
7.Realizamos una muestra cada uno, depositando en un tubo 1ml de RT y 10 µl  de orina.
8.Colocamos la muestra en el baño 5 min
9.Pasado ese tiempo medimos su absorbancia en el espectrofotometro

-Cálculos
Absorbancia de la muestra = 0,684
0,684/0,305 x 100 = 222

-Resultados 
222mg/dL de glucosa en la muestra de orina